Beispiel für eine Proteinidentifikation




Die zu identifizierenden Proteine sind als Coomassie-gefärbte Banden zu sehen und müssen zunächst exakt ausgeschnitten werden. Dabei sind Kontaminationen (z.B. Keratin von den Händen) zu vermeiden. Nach Entfärben der Gelstücke werden die Proteine reduziert (mittels DTT) und die Cysteine durch Iodacetamid inaktiviert. Es folgt eine proteolytische Spaltung der Proteine durch eine Protease (in der Regel Trypsin). Die Peptide werden mittels HPLC aufgetrennt und können optional durch einen UV- Detektor (blaue Spur) als auch mittels Massenspektrometer (als Ionendetektor rote Spur) nachgewiesen werden. Zu jedem Zeitpunkt werden die Massen der unterschiedlichen Peptide gemessen (MS Experiment) und geeignete Peptide für eine weitere Analyse  (Fragmentierung) markiert. Von jedem registriertem Peptid wird neben der Masse auch die Massen der Peptidfragmente gemessen. Die Fragmente werden durch Kollision (CID) oder Elektronenübertrag (ETD) erzeugt. Aus den Massen-Abständen der Fragmente kann die Aminoäure-Sequenz des Peptids ermittelt werden. Diese "Sequenzierung" erfolgt später durch einen Vergleich automatisch. Von allen MS-Experimenten (oft mehrere 1000), die während eine HPLC-Laufs durchgeführt werden, wird eine "Peakliste" erstellt, die die unterschiedlichen massenspektrometrischen Ergebnisse systematisiert Diese Peakliste kann nun mittels einer speziellen Software (z.B. Mascot von MatixScience) ausgewertet werden, wobei die gemessenen Datensätze bestimmten Peptiden (und damit Proteinen) zuordnet werden. Während der Datenbank basierten Suche werden alle gemessenen Fragmentmuster mit den theoretischen Fragmentmustern aller in der Datenbank befindlichen Peptide abgeglichen. Auf diese Weise identifizierte Peptide werden den entsprechenden Proteinen zugeordnet und die Sequenzabdeckung und ein Identifikations-"Score" der entsprechenden Proteine errechnet. Befanden sich mehrere Proteine in der Probe, wird eine Proteinliste zusammengestellt.
Die Identifikation ist abgeschlossen.