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Q Exactive Plus

Bild "Gerätepool:QEP.jpg"
Q Exactive Plus

Das Massenspektrometer kann mit Hilfe seiner Detektionstechnologie (OrbiTrap) die Analyten (die entweder direkt oder noch vorheriger HPLC Trennung per ESI injiziert werden) sehr genau (5 ppm Abweichung) und einer sehr hoher Auflösung (R=140.000) gemessen werden:
So kann eine Substanz mit der Masse 1000 auf 1000,005 Da genau und neben einer anderen Masse mit dem Abstand von 0,01 Da separiert gemessen werden.
Durch die zusätzliche, enorme Geschwindigkeit als auch die Massengenauigkeit (siehe oben) ist das Gerät besonders für die Bearbeitung folgender Fragestellungen geeignet:

  1. Identifikation von komplexen proteomischen Proben (Verdau aller Proteine aus Zellen)
  2. "Labelfree" Quantifizierungen
  3. Sichere Identifizierung von Metaboliten
  4. Bestimmung posttranslationaler Modifikationen
usw.




Maldi-TOF/TOF

Bild "Gerätepool:MS_UltraFlexTreme.png"
Maldi TOF TOF


Bei "Matrix-assisted laser desorption/ionization = Maldi" werden die zu analysierenden Substanzen mittels einer organischen Matrix (z.B. α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) und einem Laserimpuls ionisiert und von dem Maldi-Target (z.B. einer Stahlplatte) in das Vakuum überführt.
Die Bestimmung der Massen erfolgt mittels einer kurzen Beschleunigungsphase und anschließender Messung der Zeit für das Zurücklegen einer bestimmten Flugstrecke (time-of-flight = TOF). Es können so sehr genaue Massen (Massengenauigkeit von unter 10ppm) gemessen werden.





Bild "Gerätepool:MS_Flugrohr_isoliert_02.jpg"
Flugrohr


Das vorhandene Maldi TOF/TOF Massenspektrometer (UltraflexTreme der Firma Bruker) ist insbesondere geeignet für

  1. Bestimmung des Molekulargewichts ganzer Proteine
  2. N- und C-terminale Sequenzierung gereinigter Proteine (ISD oder T3 Sequenzierung)
  3. Maldi Imaging
  4. MS-Fingerprint der Peptide eines Proteins
  5. MS/MS (interne Sequenzierung) von Peptiden
  6. sensitiver Nachweis von Zellmetaboliten (z.B. Phosphat-Derivaten wie ATP, Glukose-6-P uvm.)


Bild "Gerätepool:MS_Maldi-Target.png"
Target Platte





Ionenfalle

Bild "Gerätepool:MS_AmazonSpeedETD_01.png"
Amazon Speed ETD


Die Ionisierung und Trocknung der zu analysierenden Substanzen erfolgt bei einer Ionenfalle durch ein vorgeschaltetes Versprayen des Flüssigkeitsstroms bei niedrigen oder hohen pH-Werten (ESI = Electro Spray Ionisation).
Die Ionen werden anschließend durch verschiedenen fokusierende Einheiten (Octupole, Ion funnel) in eine 3D-Ionenfalle (Paul's Falle von Wolfgang Paul) geleitet und deren Massen bestimmt.
Die Substanzen können zudem durch verschiedene Methoden (z.B. CID =collision induced dissociation oder ETD =Electron tranfer dissociation) fragmentiert und die Massen der Bruchstücke ebenfalls bestimmt werden. Aus dem Fragmentpattern ist die Struktur des Analyten bestimmbar (z.B. Aminosäure-Sequenz von Peptiden).



Bild "Gerätepool:MS_Quadropol_01.jpg"
Quadrupol zur Fokussierung von Ionen


Die vorhandene Ionenfalle (Amazon Speed ETD der Firma Bruker) eignet sich insbesondere für

  1. Sequenzierung kleinerer intakter Proteine (ETD)
  2. Bestimmung der Masse nicht-kovalenter Komplexe
  3. Identifizierung von Proteinen nach Proteolyse
  4. Nachweis posttranslationaller Modifikationen (z.B. Phosphorylierung, Glykosylierung)
  5. Quantitative Proteomics (SILAC, labelfreie Quantifierung)
  6. Nachweis niedermolekularer Substanzen




HPLC

Bild "Gerätepool:MS_HPLC_252.jpg"
nano-HPLC

Mit Hilfe einer HPLC (High-performance liquid chromatography) können die einzelnen Substanzen aus Gemischen getrennt werden, in dem sie zunächst an eine stationäre Phase (Säulenmaterial) gebunden und im Anschluss daran wieder sukzessive eluiert werden.
Nebenbei werden die Proben entsalzt und in der Regel angesäuert, was eine ideale Voraussetzung für die anschließende massenspektrometrische Analyse darstellt.
Weiterentwicklungen der HPLC führten zu einer immer weiteren Reduktion des notwendigen Durchflusses (von 1 ml/min hin zu 300 nl/min) und damit zu einer deutlichen Konzentration der Substanzen. In Folge konnten die Säulendurchmesser immer mehr verkleinert werden (siehe Foto).
Deshalb spricht man heute von sogenannten nano-HPLCs.
Es stehen zwei Ultimate 3000 der Firma Dionex zur Verfügung.

Bild "Gerätepool:MS_HPLC-Saeulen.jpg"
Entwicklung der Chromatografie-Säulen



Für die Injektion müssen die Proben in spezielle Fläschchen (HPLC-Vials oder Autosampler-Vials) abgefüllt werden.
Die eluierten Substanzen können dann direkt per ESI in eine Ionenfalle (LC-ESI) geleitet oder durch einen Fraktionssammler auf einem Maldi-Target (LC-Maldi) abgesetzt werden.

Bild "Gerätepool:MS_Autosampler_252.jpg"
Ein Blick in den Probengeber





Sprayer/Spotter

Bild "Gerätepool:MS_Spotter_252.jpg"
Sprayer für Maldi Imaging



Für Maldi-Imaging steht ein Sprayer (der Firma Sunchrom) zur Verfügung, um auf Gewebe-Ultradünnschnitte hauchdünn Matrix aufzutragen.
Die gleiche Apparatur kann auch den aus der HPLC kommenden Flüssigkeitsstrom mit Matrix vermischen und in bestimmten Intervallen auf ein Maldi-Target absetzen.